The regulatory switch of F1-ATPase studied by single-molecule FRET in the ABEL Trap
F1-ATP酶是膜包埋酶FoF 1-ATP合酶的可溶性部分，其催化真核细胞和真细菌细胞中三磷酸腺苷的产生。相反，F1部分也可以在三个催化结合位点快速水解ATP。因此，必须在细胞中最小化F1（或FoF 1）对“非生产性”ATP水解的催化作用。在细菌中，ATP亚基被认为通过机械地将其C末端插入F1的旋转马达区域来控制和阻断ATP水解。我们研究了这一拟议的机制，通过标记F1特异性与两个荧光团监测的C-末端的Förster共振能量转移的α亚基。单个F1分子被反布朗电动势阱捕获在溶液中，该反布朗电动势阱将FRET标记的F1保持在原位数百毫秒的延长观察时间，受光漂白的限制。比较不同生化条件下单个F1和FRET直方图的FRET变化，以评估拟议的调控机制。
2014-02-08 q-bio.BM
Fast ATP-dependent Subunit Rotation in Reconstituted FoF1-ATP Synthase Trapped in Solution
FoF 1-ATP酶是一种广泛存在的膜结合的旋转马达酶，可以催化ATP的合成和水解。它们的酶动力学受内部亚基旋转、底物和产物浓度、机械抑制机制以及质子跨膜的电化学电位控制。单分子Förster共振能量转移（smFRET）已被用于检测包埋在自由扩散脂质体中的FoF 1-ATP酶内的亚基旋转。我们现在报告，动力学监测功能旋转可以延长从毫秒到秒，利用反布朗电动势阱（ABEL陷阱）。这些延长的观察时间使我们能够观察溶液中单个FoF 1-脂质体的功能旋转的波动速率。ATP依赖的催化速率的广泛分布被揭示。质子的电化学势的积累被证实限制ATP水解的最大速率。在存在离子载体或解偶联剂的情况下，在单个重构FoF 1-ATP酶中测得的最快亚基旋转速度为每秒180个完整轮。这是更快地比生化系综平均测量，但没有那么快的最大转速之前报道的分离的单个F1复合物从膜包埋的Fo复合物解偶联。ABEL陷阱测量的进一步应用应有助于解决这种波动率的亚基旋转的机械原因。
2021-06-26 q-bio.BM
Kinetic proofreading at single molecular level: Aminoacylation of tRNA^{Ile} and the role of water as an editor
蛋白质合成中的校对/编辑对于准确翻译来自遗传密码的信息至关重要。在这篇文章中，我们提出了一个动力学校对机制，采用水解的错误的底物作为酶催化反应中的判别步骤的效率的理论研究。我们考虑tRNA^{Ile}的氨酰化，这是蛋白质合成中的关键步骤，现在已有实验结果。我们提出了一个增强的动力学计划，然后采用随机模拟算法的方法，以获得时间依赖的浓度的不同物质参与的反应和它们的形成率。我们获得的产品形成和ATP水解的正确和错误的底物（异亮氨酸和缬氨酸在我们的情况下），在单分子酶以及合奏酶动力学的速率。本理论方案正确地再现了（i）异亮氨酸和缬氨酸之间总速率的鉴别因子的幅度，其获得为（1.8 \times 10 ^2）。(4.33 \times 10 ^2）= 7.8 \times 10 ^4，（ii）在tRNA^{Ile}的氨酰化中，Ile和Val在不同底物浓度下的ATP水解速率。本研究表明，在缬氨酸的情况下，反应速率对tRNA^{Ile}浓度的非米氏型依赖性。在稳态下的编辑被发现是独立的氨基酸浓度。有趣的是，在高底物浓度下计算的缬氨酸的ATP水解速率与Ile-tRNA^{Ile}的形成速率相同，而在中等底物浓度下ATP水解速率相对较低。
2013-04-06 q-bio.BM
Kinesin as an electrostatic machine
驱动蛋白和相关的马达蛋白利用ATP燃料以进行性和定向的方式沿着微管的外表面推进它们自己。我们表明，所观察到的阶梯状运动是可能的，通过随时间变化的电荷分布提供的ATP水解循环，而微管上的静电荷配置提供了运动的指导。因此，虽然化学水解能诱导适当的局部构象变化，电机平移能基本上是静电。力学运动方程的数值模拟表明，持续性和方向性的驱动蛋白和微管的不同电荷分布之间的ATP依赖的静电相互作用的直接后果。
2006-10-24 cond-mat.stat-mech physics.bio-ph q-bio.BM
Understanding Mechanochemical Coupling in Kinesins Using First-Passage Time Processes
驱动蛋白是一种以步进方式沿微管运动的进行性马达蛋白，其运动由ATP水解提供动力。最近的实验已经研究了单个驱动蛋白分子的各个步骤和ATP水解之间的耦合，明确考虑到向前步骤，向后步骤和determination。动力蛋白中的机械化学耦合的理论研究，扩展了成功地用来描述传统的马达蛋白的动力学的方法，提出。驱动蛋白从微管的不可逆determination的可能性也明确考虑。利用首次通过时间方法，采用最简单的两态模型对驱动蛋白中机械化学耦合的实验数据进行了全面的描述。结果表明，驱动蛋白向前或向后移动一步，或不可逆地解离的停留时间是相同的，虽然这些事件的概率是不同的。它的结论是，目前的理论观点，只有马达蛋白分子的向前运动耦合到ATP水解，是一致的所有可用的实验观察驱动蛋白。
2004-06-24 cond-mat.soft cond-mat.stat-mech q-bio.BM
Drug transport mechanism of P-glycoprotein monitored by single molecule fluorescence resonance energy transfer
在这项工作中，我们监测的P-糖蛋白（Pgp）的催化机制，使用单分子荧光共振能量转移（FRET）。Pgp是转运蛋白的ATP结合盒家族的成员，存在于动物细胞的质膜中，在那里它参与ATP水解驱动的疏水分子的输出。当表达于癌细胞的质膜时，Pgp的转运活性可通过将大多数疏水性药物从细胞内部排除而导致化疗失败。尽管正在进行的努力，Pgp耦合MgATP的结合和水解的药物分子的跨脂质双层易位的催化机制知之甚少。利用定点突变技术，我们将半胱氨酸残基引入Pgp的核苷酸结合域（NBD）的不同区域进行荧光标记。双标记的单个Pgp分子在药物刺激的ATP水解过程中表现出波动的FRET效率，这表明NBD在催化过程中发生了显着的运动。应用占空比优化的交替激光激发（DCO-ALEX）以最小化FRET伪影并选择适当的分子。数据表明，Pgp是一种高度动态的酶，在稳态周转期间似乎在至少两种主要构象之间波动。
2011-02-01 physics.bio-ph q-bio.BM
Regulatory conformational changes of the epsilon subunit in single FRET-labeled FoF1-ATP synthase
FoF 1-ATP合酶是细菌FoF 1-ATP合酶的内在调节因子，FoF 1-ATP合酶是一种普遍存在的膜包埋酶，在大多数生物体中利用质子动力合成三磷酸腺苷（ATP）。大肠杆菌酶F1部分的X射线结构显示，β-内酰胺酶的C-末端结构域可以延伸到α和β亚基形成的中央空腔中。这种插入阻止了中心γ亚基的旋转，从而防止了浪费的ATP水解。在这里，我们的目标是开发一个实验系统，可以揭示条件下，在这种条件下，在体外抑制全酶FoF 1-ATP合酶。标记的C-末端结构域的的α和γ亚基特异性与两个不同的荧光团的单分子Foerster共振能量转移（smFRET）允许监测构象的α在重构的酶在实时。为未来的三色smFRET实验制作了新的突变体，以揭示p53中调控构象变化的细节。
2014-02-16 q-bio.BM
Subunit rotation in single FRET-labeled F1-ATPase hold in solution by an anti-Brownian electrokinetic trap
FoF 1-ATP合酶催化三磷酸腺苷（ATP）的合成。F1部分可以从酶的膜包埋的Fo部分剥离。F1充当ATP水解酶，并且ATP水解与F1的γ亚基和γ亚基的逐步旋转相关。在过去的15年里，使用附着在表面上的单个F1部件对这种旋转运动进行了详细的研究。通过结合的荧光肌动蛋白丝、纳米珠或纳米棒或单个荧光团的视频显微镜监测γ的亚基旋转。或者，我们应用单分子Förster共振能量转移（FRET）监测亚基旋转的全酶FoF 1-ATP合酶在脂质体中重建。现在，我们的目标是延长观察时间的单一FRET标记的F1在溶液中使用的反布朗电动势陷阱（ABELtrap）的修改版本发明的A。E. Cohen和W. E.莫尔纳我们使用Monte Carlo模拟来揭示逐步FRET效率变化可以通过隐马尔可夫模型来分析，即使在预期由于ABELtrap的微流体引起的高背景计数率而导致的低信号背景比的限制下。
2013-02-23 physics.bio-ph q-bio.BM
Action mechanism of DDX3X: An RNA helicase implicated in cancer propagation and viral infection
DDX 3X是一种与许多癌症和病毒进展有关的人DEAD盒RNA解旋酶。除了RecA样催化核心外，DDX 3X还含有N-和C-末端结构域。在这里，我们调查的底物和蛋白质的要求，以支持从其C-末端结构域缺乏80个残基的DDX 3X构建的ATP酶活性。我们的数据证实了先前的结果，即对于支持DDX 3X的ATP酶活性的RNA分子，它必须包含单链-双链区域。我们研究了这种要求的蛋白质和RNA结构原因。首先，仅由双螺旋组成的RNA底物不能支持DDX 3X结合。单链RNA底物支持DDX 3X结合，而由单链-双链区域组成的RNA底物不仅支持DDX 3X与RNA的结合，而且促进DDX 3X三聚体的形成。因此，DDX 3X三聚体形成需要单链-双链RNA区域，而ATP酶活性需要三聚体形成。有趣的是，ATP水解对蛋白质浓度的依赖性表明DDX 3X三聚体仅水解两个ATP分子。最后，含有单链-双链区域的DNA底物不支持DDX 3X的ATP酶活性。
2017-07-12 q-bio.BM
Mechanism of unidirectional movement of kinesin motors
驱动蛋白马达已经在实验和理论上得到了广泛的研究。然而，驱动蛋白进行运动的微观机制仍然是一个悬而未决的问题。在本文中，我们提出了一个手在手模型的驱动蛋白，这是基于化学，机械和电气耦合的持续合成能力。在该模型中，进行性运动不需要依赖于两个头部在ATP水解和机械循环中的协调。相反，在两个头部的ATP水解是独立的。尾部头部的ATP酶速率比头部高得多，使得运动行走以自然的方式进行，每一步水解一个ATP。该模型与驱动蛋白的结构研究和驱动蛋白ATP酶的测定途径相一致。利用该模型估算的驱动力为~ 5.8pN，与实验结果（5~ 7.5pN）一致。一步移动时间的预测（~10微秒）也与0~50微秒的测量值一致。解释了先前观察到的8 nm台阶内的子台阶。速度-载荷（正负）曲线的形状与以前的实验结果相似。
2003-12-30 q-bio.BM
Nucleotide-induced conformational motions and transmembrane gating dynamics in a bacterial ABC transporter
ATP结合盒（ABC）转运蛋白是一种重要的膜蛋白，通过ATP水解介导多种底物的跨膜交换。我们报告的细菌血红素转运蛋白HmuUV进行粗粒度动力学模拟的结果。基于无核苷酸结构，我们构建了一个配体弹性网络描述这种蛋白质，并研究了ATP诱导的构象运动的结构分辨计算机实验。正如我们所发现的，与核苷酸的相互作用导致了功能性和鲁棒性的通用运动。在结合的ATP模拟配体的结构改变，从构象中的核苷酸结合结构域形成一个开放的形状，构象中，它们被发现在紧密接触和跨膜结构域被旋转。血红素通道在配体结合的复合物中被拓宽，并且通过涉及基本跨膜螺旋的倾斜运动的机制打开了在无核苷酸构象中被关闭的细胞质的门。基于我们的研究结果，我们提出，HmuUV转运蛋白的行为就像一个“简单”的机械装置，其中，诱导ATP配体的结合，线性运动的核苷酸结合域被翻译成旋转运动和内部倾斜动力学的跨膜结构域，控制门控血红素途径内。
2014-02-07 cond-mat.soft physics.bio-ph q-bio.BM
Actin Polymerization Kinetics, Cap Structure and Fluctuations
肌动蛋白聚合成动态结构是真核细胞生命所必需的。这促使了大量的体外实验测量单个长丝的聚合动力学。在这里，我们模拟这些动力学，占所有相关的步骤实验揭示：聚合，解聚，随机ATP水解和释放磷酸盐（Pi）。我们与长丝的生长速率的动态ATP-肌动蛋白和ADP-Pi-肌动蛋白帽在长丝末端的发展。在倒刺末端的临界浓度c_crit处，我们发现短ATP帽和长波动稳定的ADP-Pi帽。我们发现，增长率和临界浓度在倒刺结束是密切相关的帽结构和动力学。细丝长度的波动用长度扩散系数D来描述。最近，Fujiwara等人[Nature Cell Biol.（2002）4，666]和Kuhn和Pollard [Biohys. J.（2005）88，1387]观察到略高于c_crit的大长度波动，引发了人们的猜测，即生长可能是通过低聚物而不是单体开关事件进行的。对于单个单体的生长过程中，我们发现，$D$表现出一个明显的峰值低于c_crit}，由于长丝之间的交替加盖和uncapped状态，一个温和的版本的动态不稳定的微管。c_crit以上的波动增强，但比实验报告的要小得多。未来测量D作为浓度的函数可以帮助确定所观察到的波动的起源。
2005-06-19 cond-mat.soft physics.bio-ph q-bio.BM
Iterative Annealing Mechanism Explains the Functions of the GroEL and RNA Chaperones
分子伴侣是消耗ATP的生物机器，其促进蛋白质和RNA分子的折叠，所述蛋白质和RNA分子在动力学上长时间被困在错误折叠状态。无辅助折叠通过动力学分配机制发生，根据动力学分配机制，以低概率折叠到天然状态以及以高概率错误折叠到许多亚稳态之一，在类似的时间尺度上迅速发生。GroEL是一种多用途的随机机器，可以帮助错误折叠的底物蛋白（SP）折叠。RNA分子伴侣（CYT-19）帮助容易错误折叠的核酶折叠。GroEL不与折叠的蛋白质相互作用，但CYT-19破坏折叠和错误折叠的核酶。尽管存在这一主要差异，迭代退火机制（IAM）定量地解释了蛋白质和核酶辅助折叠的所有可用实验数据。在ATP结合和水解以及GroES结合的驱动下，GroEL经历催化循环，在此期间，它采样三种变构状态，称为T（apo）、R（ATP结合）和R“（ADP结合）。与IAM预测一致，实验数据的分析表明GroEL-GroES机制和突变体的效率由重置速率$k_{R''\rightarrow T}$决定，其对于野生型GroEL是最大的。广义IAM精确预测了四膜虫核酶及其变体的折叠动力学。分子伴侣通过驱动底物脱离平衡而使折叠速率和稳态天然状态折叠的乘积最大化。绝对产率和折叠速率都没有优化。
2019-09-16 physics.bio-ph q-bio.BM
Mechanism of robust circadian oscillation of KaiC phosphorylation in vitro
通过将三种蓝藻蛋白KaiA、KaiB和KaiC的混合物与ATP在体外孵育，Kondo和他的同事重建了KaiC磷酸化水平的强大昼夜节律（Science，308; 414-415（2005））。这一发现表明，蛋白质相互作用和相关的ATP水解足以产生昼夜节律。已经提出了几种理论模型来解释这种“仅蛋白质”系统中产生的节律，但尚不清楚区分不同可能机制的明确标准。在本文中，我们讨论了一个模型的基础上的两个基本假设：一个KaiC六聚体的变构转换的假设和KaiC六聚体之间的单体交换的假设。该模型显示了KaiC磷酸化水平的稳定节律振荡，这对Kai蛋白浓度的变化是稳健的。我们表明，这种鲁棒性提供了一个线索，以区分不同的可能机制。我们还讨论了振动对系统大小变化的鲁棒性。细胞或亚细胞大小的系统的行为应该阐明蛋白质相互作用在体内昼夜节律振荡中的作用。
2008-05-07 cond-mat.dis-nn q-bio.BM q-bio.MN
Twirling motion of actin filaments in gliding assays with non-processive myosin motors
我们提出了一个模型研究的滑翔测定中，肌动蛋白丝移动的非进行性肌球蛋白马达。我们表明，即使动力蛋白的动力行程没有横向分量，细丝将围绕其轴旋转，同时在表面上移动。值得注意的是，这种旋转运动的旋向与肌动蛋白丝结构的旋向相反。这是因为滑动的肌动蛋白丝有“靶区”，在那里它的亚基指向表面，因此更容易被肌球蛋白头接近。每个肌球蛋白头在到达靶区中心之前比之后具有更高的结合概率，这导致左旋旋转。我们提出了一个随机模拟和近似的解析解。计算的旋转运动的节距取决于细丝速度（ATP浓度）。它在低速时达到约400 nm，并随着速度的增加而增加。
2009-06-04 cond-mat.soft physics.bio-ph q-bio.BM
